[农学]分子生物学实验技术讲义 138页

分子生物学实验技术基因是什么？这是一个颇让人为难的问题。尽管近半个世纪以来人们采用分子生物学技术、基因工程技术在认识基因和人为改造基因方面都做得非常出色，可是科学家们仍然不能对基因给出一个圆满的定义。我国著名遗传学家谈家桢先生曾撰一文《基因概念的发展》详尽说明基因概念是随着日益增多的科学事件的发展而发展的这一事实，也提示人类对基因本质的认识还有很长的路要走。   基因一词是英语“gene”的音译，是“开始”、“生育”的意思。它源于印欧语系，后变为拉丁语的“gens”（氏族）以及现代英语中genus（种属）、genius（天才）、genital（生殖）等诸多词汇。1909年，丹麦学者约翰逊提出基因这一名称，用它来指一种生物中控制任何遗传性状而其遗传规律又符合孟德尔定律的遗传因子。  \n在孟德尔定律之前，人们对生物遗传曾经提出了诸多的说法。如普遍流行的融合遗传论就是认为双亲的遗传物质在子代中像血液一样混合，被稀释且不能分开，但孟德尔的实验结果则相反，现代隐性基因并不在杂交子一代中消失，它所决定的性状还能在子二代中出现。据此孟德尔提出了“遗传颗粒”学说。20世纪初孟德尔理论在许多动植物中得到了进一步的验证。最有代表性的是1910年美国科学家摩尔根发现果蝇的白眼性状的伴性遗传现象，即白眼性状始终在雄果蝇中出现，第一次把一个特定的基因定位于一条的染色体（决定性别的性染色体）上使遗传学和细胞学终于殊途同归。有人曾对此作了一个形象的比喻：若将孟德尔学说比作是从生物雄壮的交响乐中分解出七个音符，那么孟德尔的染色体遗传理论则不仅证实了六弦琴上六根琴弦的存在，而且证明了这七个音符就是从这只六弦琴上发出来的。  孟德尔学说和摩尔根的基因论都把基因看作是一个界线分明的独立遗传单位，甚至到本世纪50年代初人们在对基因的化学本质（核酸）及DNA双螺旋结构有了明确认识后，仍然认为基因是不可分的基本遗传单位，如同当初人们分子是物质的基本粒子一样。这种观念直到1957年得到纠正。 著名遗传学家本泽尔在经过10年艰苦工作，取得了三大发现后提出了全新的基因概念，于是彻底冲破了经典基因不可分的概念。他认为：（1）作为基因的单位，可以精确到单核苷酸或碱基水平，称为突变子。（2）作为交换单位，同突变单位一样，仍以单核苷酸为基本单位，称为互换子。（3）作为功能单位，基因也是可分的。本泽尔的功劳不仅在于提出了全新的基因概念，而且把“基因”作为一种概念引入到遗传学实验中来了。本泽尔把突变子或互换子像绘制染色体图一样排列在基因图谱上，这是遗传学上一次从宏观到微观的飞跃。 \n1969年，夏皮罗等人从大肠杆菌中分离开分离到乳糖操纵子并使它在离体条件下转录，证实了一个基因可离开染色体而独立发挥作用。1970年，梯明发现了仅以RNA作为遗传物质的逆转录病毒，提示遗传物质不仅仅是DNA，也可以是RNA，从而使中心法则内容得到扩展。  时隔20年后的1977年，人们又在猿猴病毒（SV40）和腺病毒（AdV）中发现某些基因中存在内部间隔区，间隔区的顺序与基因所决定的蛋白质序列没有任何关系——这使科学家们大吃一惊。随后，基因的这种可分割、不连续的现象在酵母tRNA基因、国蝇的rRNA基因、人的胶原蛋白基因中也得到了证明。这样基因的概念中又多了一项新内容：基因结构具有不连续性。因为这是生物界尤其是真核生物中普遍存在的现象，为了便于称呼，人们把这种分裂基因中能实现遗传信息表达的部分称作外显子，而不表达部分称作内含子。  1980年法国科学家斯洛宁姆斯基在酵母线粒体DNA的研究中证实，一个基因的内含子可能是另一个基因的外显子，也就是说，内含子也可能是具有功能的，剪接酶并没有把它们带到死亡中去，生物界中DNA的所有成员可能没有废料。  与基因分裂或不连续性的概念相反的是基因的重叠性。1977年桑格等在噬菌体X174DNA中和1978年菲尔斯等在SV40DNA中均发现了几个基因共用同一段DNA序列的情况。虽然这种现象在自然界并不普遍，但是至少生命基因确实存在着阅读框架的重叠现象，这体现了生物的“节约”原则。  \n对经典的、近代的以至现代的基因概念的挑战还不止这些。比如，一个基因一个多肽假说，在相当长的时间被证明是正确的，可是近年来发现一些基因绝不产生任何蛋白质或者多肽，而仅产生RNA，各种tRNA、rRNA基因就是这样。因此人们只有加以补充：基因的功能在于决定蛋白质或核酸。但是这仍不能解释一些事实：DNA中确实存在一些片段，它根本不产生任何物质而仅以文字或结构起作用。例如，操纵区和启动区，它仅起识别蛋白质（酶）的作用，由此来开放或关闭它“下属”的活动。而另一些基因，如假基因，眼下甚至还看不出有什么作用。这样就很难从产物上给基因下一个统一的定义。本世纪70年代末，大肠杆菌中发现了一种奇特的现象，基因可以在染色体及染色体外的DNA之间往返“飞行”。其实这种基因的跳跃现象在50年代初就被一位女科学家麦克琳托克在研究玉米组织分化现象时发现，只不过她的发现当时并未引起人们的普遍关注而已。随后不久基因跳跃现象又在人的免疫球蛋白基因得到了证实，这样人们才充分意识到基因的稳定性是相对的。医学家们还进一步设想或许基因的这种不稳定性可能与癌症和传染性疾病也可能有很大关系。麦克琳托克作为首次发现基因不稳定性的人，于1983年获得了诺贝尔生理学及医学奖。   由于基因在高等生物中相当庞大，人类基因组中究竟含有多少基因，基因的表达又是如何调控等都是目前悬而未决的问题。现在国际上提出的“人类基因组计划”和“人类基因组后计划” 的国际合作研究，目的就在于回答这些问题。基因究竟是什么？我们从以上的下上叙述中可粗略地知道基因是含特定遗传信息的核苷酸序列（DNA或RNA），是遗传物质的最小功能单位。但是目前为止还没有人能给它下个完整的定义。基因的概念将随着科学事实的不断发展而发展。（未经作者同意,不得用于任何纸媒体,网络转载请注明作者和出处!）\n1：核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。最常用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用 PC \n对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。 2：裂解方法的评价含蛋白酶的裂解方法，仍然可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组 DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。另外，象有些样品，如肌肉，即使是 RNA \n抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，并且能迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 \nPCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。该方法最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是否是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可以差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。3：纯化方法评价PC \n抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸 (因为不可能将水相全部移取)，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力 \n(不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留)。不过，介质纯化方法的成本是最高的。4：醇的沉淀醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质 – 主要是盐 – 的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 (当然，得率可能会降低)。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题 – 主要是纯度问题 – 时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是 TRIzol \n提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。结合丢失和洗涤两个方面综合考虑，则建议：少量核酸用异丙醇沉淀 (量少，洗涤不是问题，不丢失为先)，大量核酸用乙醇沉淀 (量大，丢失不是问题，洗涤方便为先)。至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我没有碰到过 (我几乎不使用低温沉淀，难道低温沉淀比较容易出现盐沉淀？)；我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提操作在 1.5ml \n离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次，质量决不会有问题的。PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。5：洗涤洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。教科书中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”，这一描述本身没有问题，且十分方便，但因为他来自国外，自然就有了“水土不服”\n的问题。如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常彻底；好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。唯一不受管子质量影响的操作，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。一定要牢记的是，残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。另外，核酸沉淀的大小也决定了洗涤的强度。沉淀越大，放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加。6：核酸质量的检测问题将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光广度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围)，该方法还是非常可信的；另外，电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光广度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光广度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更准确的判断。但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。7：PC 抽提PC 抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA \n造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会对部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀 – 此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。8：样品与裂解液的比例起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果 (纯度及得率) \n没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。9：蛋白质是如何残留的PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。 10：小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。 \n11：标准化的概念所谓的标准化，指的是一套程序，确保不同的人能获得质量接近的产物的程序。标准化并不是以获得最高质量为目标，而是以稳定为目标。标准化的核心是质控。事实上，核酸抽提的每一步操作，都有一个核心；重要的是找到可观察的指标或者现象作为参考，从而确保实验的成功。如悬浮的核心是没有块状物的存在，彻底消化的核心是没有块状物的存在，PC 抽提的核心是混匀-两相成为乳状，取上清的核心是用小一点的移液器移取液体，吸取时 Tip 的尖头尽可能接近液面，吸取速度要慢，并且要留下 1mm 以上的液体不要再吸。去上清的核心是先倒空，再短暂离心将残留液体离到管低，用移液器彻底移出。洗涤的核心是彻底悬浮沉淀，并且要放置一段时间 (时间长短与沉淀大小有关) \n使沉淀内部也能被洗涤到。按这样的方法抽提的核酸，其质量是非常稳定的。柱离心式实际上就是非常标准化的核酸沉淀与洗涤的操作。一般而言，柱式操作出问题，系统性的与试剂盒有关，偶然性的与操作有关。这一点，应该是可以理解的。一个方法，其标准化程度越高，其稳定性就越好。步骤越少，标准化就越容易。产品的开发也要以高标准化程度为目标。12：QC 的概念QC 概念远没有 QT 概念深入人心。最高境界的产品追求的是免检，或者是 Trouble-free。另外，现在的许多产品也是不允许 QT 的 (因为是一次性的)，因此就只能靠 QC 来保证质量了。QC 是将精力集中在过程中：原料、操作等。只要严格按照标准去做，最终的结果就有保证。事实上，很多实验人员是不做检测而直接将抽提好的核酸用于后续实验的；他们之所以可以这么做，是因为他们有意无意之中非常的注意 QC。也有不少人，尤其是新手，Pay no attention to QC，只知道最后的 QT。一旦发现问题，就去逆推原因；但因为过程中所出现的现象根本就没有注意，几乎不可能准确找出真正的原因的。如果 QC 做得好，最后的 QT 是否全部做/部分做/完全不做，取决于时间、经验、后续实验的成本等因素。13：EP 管的问题几乎没有人会认为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象 (如核酸在 -20C 保存一天后发生了降解) 有关系，但事实是，EP \n管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。硅化可以提供最高质量的 EP 管，使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。最糟糕的 EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子是很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总是不令人放心的。我个人认为，只有硅化过的 EP 管，才可能按照标准操作获得满意的结果。否则，某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。14：核酸抽提中的温度问题核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好的选择。那些认为“低温操作可以防止降解”\n之类的理由，并没有多少可信度的。15：如何阅读操作手册拿到操作手册后，要倒着阅读：先阅读问题解答，再看操作步骤下面的说明，再看操作步骤。问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦，操作步骤下面的说明是商家的警告。没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂，因为这是满足使用人员习惯的结果。一句话，PS 和 By the Way 之类的话中含有真正的有用素材。16：其它核酸抽提的每一步操作，都是利弊权衡的结果。消化要彻底，时间就会长；PC 抽提时多取上清，得率会提高，但增加了蛋白质污染的风险；沉淀使用低温且时间长，得率会提高，但增加了杂质污染的风险 … 不足详列。总之，核酸抽提是艺术，可以根据自己的样品及当时的情况，对操作步骤进行适当的优化。17：实验的思维核酸抽提的成功，就是每一步都没有失败。这不是玩文字游戏，而是告诉你做实验的良好思维。就如同小学基础没有打好，早晚会发现大问题一样，做实验决不要以成功为喜悦，以失败为痛苦。要保证实验成功，绝对不能有“这个操作应该没有问题”，“用这个可能不会有问题”\n之类的侥幸心理。去掉任何一个可能使实验失败的因素，这才是实验该有的出发点。用这样的出发点，实验几乎没有不成功的，所以说，实验成功没有什么快乐；实验的快乐来自于：发现自认为不会导致失败的某因素实际会导致实验的失败。学到了这样的知识，才有快乐的理由。18：EB 在 NA 抽提中的运用EB 在 NA 抽提中的应用，用于电泳，人皆尽知；用于 gDNA 抽提时提高蛋白质与 gDNA 的分离效率，却似乎没有人再考虑了，因为大家都怕使用 EB。在 NA 抽提中涉及到 EB 的另外一大类，就是胶回收操作了；EB 在胶回收中扮演的角色，就不完全是正面的。如果 NA 与 EB 充分接触，EB 就会以每隔数个碱基的频率均匀地插入 NA 之中。EB 的这种插入，无疑更可能破坏核酸双链的稳定性，使核酸由双链变成单链的压力增加。如果核酸比较短，而错配又多 (错配的后果之一也是核酸容易由双链变成单链)，EB 的插入将更容易导致的出现。这个观点有如下的实验报告佐证：有相当部分的 PCR 产物胶回收实验，都报告说回收后的电泳结果是：目的条带变淡或者消失，同时出现了一条小的原来不存在的条带。坛中曾有文描述他做胶回收的程序：两边加 Marker，中间加产物；电泳过程不含 EB。电泳结束后，纵向割下 Marker 条带用 EB 染色后，放回胶原来的位置。开紫外，根据 Marker \n的位置割下目的条带，再回收。这是个笨办法，但这样使用的人一定是聪明人。19：核酸的保存基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。虽然也有部分实验人员发现，-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的稳定，我却宁可认为这是个例。如果温度合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解。还有一个不为人重视的，就是 EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡。EP 管的材质，首先可能吸附核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事。现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多，但其化学特征，尤其是对核酸稳定性的可能影响，远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种带型外，还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc \n等等带型。20：蛋白质残留的影响问题 (探讨，没有证据)一直对蛋白质残留不抱好感，却也没有将它看成威力无比。本节考虑的是蛋白质对酶反应的影响问题，为方便表述，我将残留的蛋白质分成同源的 (与核酸或者酶有同一或者相似的来源，如细菌) 和异源的(与核酸或者酶没有同一或者相似的来源) 两种。先看异源蛋白质的影响：内切酶几乎都在保存液中添加有 500ug/ml 的 BSA，BSA 是改善 PCR 结果的一个选项，BSA 是稳定低浓度核酸的一个选项。几乎都是正面的。可以看到，异源蛋白质对酶反应没有抑制作用，甚至还有促进作用 (虽然都是以 BSA 为例)。再看同源蛋白质的影响：AMBION 公司有一个非常有特点的产品 “Cells-to-cDNA Kit”。细胞裂解后不去除蛋白质就直接用于 RT-PCR。该例子应该可以说明，与核酸同源的蛋白质的残留对 RT-PCR 不一定有影响。另外一个例子是质粒的酶切。质粒酶切是比较容易出现一些靠 PC 纯化一次就可以解决的问题的；因为 PC 纯化基本上就是去除蛋白质，所以可以认为质粒抽提中残留的蛋白质对酶切是有巨大影响的。各位看官是否注意到这两个例子的最大区别在什么地方？区别在于残留的蛋白质究竟是与核酸同源还是与蛋白质同源。事实是，质粒抽提中残留的蛋白质是宿主菌的 (Ecoli 或者其它)，与质粒并不同源；而内切酶却是来自于 Ecoli \n或者其表弟表妹的，与宿主菌的蛋白质同源性是非常高才对。还有一个现象：EcoR I 的 Star Activity 是最明显的，其它来源于 Ecoli 的酶的该活性也不差，这是为什么？写到这，我头有点痛了，因为我没有办法证明；就是有人提供了证明，我暂时也看不到用途。毕竟，酶反应不是受单一因素影响的。如果说该思考有什么现实意义，那就是：残留蛋白质的危害可能被夸大；许多实验在重复失败，只是因为你抓住的嫌疑犯不是真凶。更大胆的假设是：BSA 可以用于某些核酸抽提，以更彻底去除与酶同源的蛋白质残留。21：无介质的核酸抽提裂解液 (不含苯酚) 的展望 (供核酸抽提产品生产商及潜在的生产商参考)经典的醇沉淀和洗涤，在无介质核酸抽提技术中，几乎是不可或缺的，尽管微调可以带来一些意想不到的效果。能展望的，也只有裂解液了。现在的裂解液，都没有同步去除蛋白质的功能；蛋白质的去除，或者靠裂解后再加入苯酚抽提去除蛋白质，或者靠加入高盐溶液去除蛋白质，效果也不错。能做的改进，看起来也就只有配制出这样一种裂解液：裂解效率高 (得率的保证)，同时蛋白质可以靠离心去除 (操作简化了)。简单地讲，下面提供的是目前可以想象的结合有高得率、高纯度、操作最简单诸多特点的操作步骤 \n(以细胞为例。组织捣碎后也适用)：在样品中加入裂解液，混匀后，静置使裂解彻底。高速离心后，蛋白质沉淀在离心管的底部，上清则为核酸。将上清转移到预先已经加入了醇的离心管中，轻轻混匀后，用一个小钩捞出大的絮状沉淀 (以DNA 为主) 到另外一个离心管中；捞不起来的 (主要是 RNA) 用离心沉底。分别洗涤蛋白质沉淀，DNA 絮状沉淀和 RNA 离心的沉淀，再分别溶解，就可以同步获得 DNA/RNA/蛋白质了。半年前我开始考虑这样的裂解液时，只是抱作玩的态度。失败后思考，思考后再失败；半年下来，试剂的配制进展有一点，但“发现”的用途却越来越多：所有原来采用苯酚抽提去除蛋白质的纯化操作，如酶切后的纯化、 DNase 降解 DNA 后的纯化 … 都可以用这样的裂解液来替代。其前景越来越美好，使内心越来越不平和；开放这个思路，我就会不那么在意了。这个裂解液应该是有比较好的经济价值的 – 即使是技术的卖价应该也不会低于 6 位数；任何人都可以用玩的心态试一试，不过不要赌博就是。22：再看紫外分光广度仪在核酸质量检测中的作用23：醇沉淀的语言 Flash – \n从低浓度核酸沉淀条件的改变看核酸是如何形成沉淀的核酸醇沉淀的原理，按照分子克隆中的描述，是用阳离子中和了磷酸根的负电荷后，核酸“无性”结合才能沉淀下来。低浓度核酸沉淀的条件一般要做如下改变：使用长时间的低温、使用更高比例的醇、使用 tRNA 之类的东西。下面就用 Flash 语言的特点，描述一下“无性”的核酸是如何结合的。溶液中的单个核酸，虽然是“无性”的，对其它的核酸，仍然是有引力的 (大小与距离相关)；同时，核酸分子受到的另外一个力，来自分子运动。在一般情况下，核酸之间的引力比分子运动产生的力小许多；只有当核酸之间的距离足够近时，引力才能克服分子运动产生的力，使两个核酸结合到一起。结合在一起的两个核酸又共同对其它的核酸产生引力 (该引力比单个核酸的要大)，结合上更多的核酸 … 最终沉淀下来了。低温和更高浓度的醇都有利于降低分子运动产生的力，tRNA 能提高总核酸浓度进而通过与目的核酸的结合提高了目的核酸之间的引力，所以低浓度核酸的沉淀条件如上。至于 2 价镁离子有利于低浓度核酸的沉淀原因，可能是镁离子要被同一核酸分子的两个磷酸根结合，这种结合的结果是核酸分子变得更立体了：引力越集中，对外就越大。24：从柱离心式产品的流行看经典方法的缺点 \n（或者操作重点）柱式方法的风行是无法否定的现实。下面通过柱式方法与经典方法的比较，看一看如何注意经典方法的操作重点。裂解，二者几乎没有任何区别。去蛋白质，柱式靠的是柱材料对蛋白质吸附力低这一特点，将蛋白质残留控制在比较低的水平 (而不是彻底去除)；经典方法最常用的是 PC 抽提，可以将蛋白质去除得更彻底一些。其它大分子杂质 - 如多糖等 - 的去除，柱式的与蛋白质的去除相似，但经典方法中却没有如此方便的对应方法。小分子物 (盐等) 的去除，在我的眼里，是柱式方法最可爱的地方。如果柱子设计没有问题，离心后柱子中残留的液体稳定而少；柱式的洗涤具有“流水洗涤”的效果；柱式中的核酸是不成团块的 - 这三个特点决定了柱式的洗涤效率比经典的洗涤效率高，所以，柱式纯化的核酸纯度比较高。结论是：裂解和去蛋白质的能力，经典方法不次于柱式方法；去除其它大分子杂质，经典方法不如柱式；洗涤能力，按目前各种参考书中的介绍去做，几乎没有办法超过柱式方法。你看一看上面柱式方法洗涤的特点，经典洗涤方法哪一条强调了。再想一想你是如何手工洗衣服的，象不象柱式洗涤的特点，就应该不会有疑问的吧。难道过去的核酸沉淀洗涤方法有错误？那倒不是。真正的原因是，过去核酸抽提使用的小分子物 \n(盐等)，多是后续酶反应中会使用到的或者起码少量的残留不会抑制后续酶反应的；现在抽提中使用的东西就不一样了，都是一些对蛋白质有强烈作用的东西，而且浓度还非常高。过去有资料强调测 A230 值吗？自打 Guanidine Thiocyanate 开始广泛用于核酸抽提后，A260/A230 比值的测定成为检测质量标准的一个非常重要的指标了。如果将洗涤操作更强化及严格一点，对于一般比较干净的样品，你会发现经典方法抽提的核酸完全可以达到非常好的质量的。柱式就还留下一个“快”的特点，当然应该说是“更快”。分子生物学实验方法与步骤DNA分子的限制性内切酶消化  限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×\n）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：        DNA                      0.2-1  μg      10×酶切buffer            2.0  μl      限制性内切酶              1-2  u（单位）      加ddH2O                   至  20 μl    限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3M \nNaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。二、电泳检测    取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。 三、注意事项1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃\n冰箱。3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。5.注意星号酶切活力。DNA片段回收与纯化     质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。一、冻融法1.  紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；2.  加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀；3.  -20℃放置5-10min；4.  4℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；5.  加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；6.  -20℃，放置5-10min；7.  4℃离心10000g×5min，合并上清液；8.  用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；9.  加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；10. -20℃，静置30min；11. 4℃离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；12.  \n加适量H2O或TE溶解沉淀。二、DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）1.   紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。2.   加入Buffer QG（每100mg凝胶加Buffer QG 300μl），置50℃水浴10min。3.   若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。4.   将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。5.   4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。6.   加入500μl Buffer QG于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。7.   加入750μl Buffer PE于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。8.   4℃离心13000g×1min。弃去收集管。9.   将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μl EB于柱上。放置1min，4℃离心13000g×1min。10. 取5μl 回收DNA电泳检测。三、 注意事项    紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。原核表达 \n    将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。    表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。    原核表达一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g \nIPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。（三）  获得含重组表达质粒的表达菌种1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、 \n以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（四）诱导表达1、 挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀, 70℃10min。5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。三 、注意事项1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。真核细胞DNA的制备与定量 \n制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。    根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。\n⑷ 60°C水浴1-3hr。2．培养细胞处理：⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。⑵ 离心4000g×5min，去除上清液。⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。⑷ 50-55°C水浴1-2hr。（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：\n    DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。    DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。2.电泳检测：   取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。真核转染 \n     一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。    利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：（1）   通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。（2）   对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。（3）   大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。（4）   研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的情况。（5）   \n通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。（6）   使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列得到表达。（7）   揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。    DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。进行真核转染的一般程序：克隆目的基因（经测序验证）－准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、试剂准备1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。二、操作步骤（一）克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。2、回收特异性扩增片段，连入T载体。3、转化DH5α\n，质粒制备。4、酶切初步鉴定，测序证实。（二）  真核重组表达载体的构建：    pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。   重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切   回收插入片段和pcDNA3线性片段   T4连接酶连接   转化DH5α   质粒制备   BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。 2、 在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。                     \n典型贴壁细胞平板密度 培养板大小  生长面积（cm2）  大约细胞数  培养基容积（ml）  组织培养皿（φ60mm）  28  6．6×105  5-6  6孔培养板（φ35mm）  9.5  3×105  1-2  12孔培养板φ22.6mm）  4  1．3×105  0．5-1  \n24孔培养板（φ8mm）  0．5  0．6×105  0．25-0．5  3、   SHG-44细胞的转染：(1)   转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。(2)   准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。① 溶液A：用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5μg 到总体积50μl（30μg/ml）。②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl（120μg/ml）。③混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。(3)   不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。(4)   37℃孵育6hr。(5)   6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。(6)   转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。4、   \nG418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。（一）筛选结果鉴定：（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western-blot）。（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响    ①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。    ②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。    ③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。三、注意事项1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ \nDNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。   脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。（未经作者同意,不得用于任何纸媒体,网络转载请注明作者和出处!）分子生物学实验技术(第二章DNA酶切及凝胶电泳)第二章 DNA酶切及凝胶电泳第一节 概 述 　　一. DNA的限制性内切酶酶切分析 　　限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如Sma\nⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 　　5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 　　3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' 　　DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 \n　　DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 　　构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 　　在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 　　二. 凝胶电泳　　琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 \n　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 　　1、 DNA的分子大小: 　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 　　2、 琼脂糖浓度　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 　　3、 DNA分子的构象 \n　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 　　4、 电源电压 　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 　　5、嵌入染料的存在 　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 　　6、 离子强度影响 　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA \n(pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。  第二节 材料、设备及试剂 　　一、 材料 　　λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 　　二、 设备 　　水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。 　　三、 试剂 　　1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 　　2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 　　3、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。  第三节 操作步骤 　　一、 DNA酶切反应 　　1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μ\nl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 　　2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 　　3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 　　二、DNA分子量标准的制备 　　采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段,长度 分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。 　　三、 琼脂糖凝胶的制备 　　1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 　　2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×\nTBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 　　3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 　　4、 加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 　　5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 　　6、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μ\ng/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 　　7、 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。 　　8、 DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。 　　9、 DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 　　10、 DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。 \n　　[注意] 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 　　2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 　　3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。 　　4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。 　　5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 　　6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。 分子生物学实验技术(第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化)\n第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节 概 述 　　在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。　　转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 　　转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 \n法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 　　1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。　　2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 　　3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 　　4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 　　本实验以E.coli DH5a\n菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。  第二节 材料、设备及试剂 　　一. 材料　　E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf管。 　　二. 设备 　　恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。 　　三. 试剂 　　1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。 　　2.Amp母液：配方见第一章。 　　3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。\n 　　4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。 　　5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。　　6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。  第三节 操作步骤 　　一、 受体菌的培养 　　从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。 　　二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 　　1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。　　2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 　　3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 \n溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。　　4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。 　　三、 转化 　　1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。　　2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 　　3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 　　4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 　　5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 　　同时做两个对照: 　　对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 　　对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 \n　　四、 计算转化率 　　统计每个培养皿中的菌落数。 　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 　　[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。  分子生物学实验技术(第四章RNA的提取和cDNA合成)第四章 RNA的提取和cDNA合成第一节 概 述 \n　　从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。　　一、RNA制备　　模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃\n烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。　　细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 　　二、cDNA第一链的合成　　所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 \nDNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。 　　AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。　　三、cDNA第二链的合成　　cDNA第二链的合成方法有以下几种: 　　(1) 自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。 　　(2) 置换合成法 \n该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。　　四、cDNA的分子克隆 　　已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。  第二节 动植物组织mRNA提取 　　一、材料 　　水稻叶片或小鼠肝组织。 　　二、设备 　　研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。　　三、试剂 　　1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 \n　　2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 　　3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。　　4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。　　四、操作步骤 　　（一）动植物总RNA提取-Trizol法 　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。　　1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 　　3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。 　　4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g\n离心5分钟。　　5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。　　[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 　　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。　　（二）mRNA提取 　　由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。 　　1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。 　　2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 　　3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。　　4、将（一）中提取的RNA液于65℃\n温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。　　5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。 　　6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。 　　7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30分钟。 　　8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。　　9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。 　　10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。 　　[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 　　2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。  第三节 植物病毒RNA提取 　　大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。 　　一、材料 　　提纯TMV病毒液（10mg/ml）。 \n　　二、设备 　　冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。 　　三、试剂 　　TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA酶的双菌水。 　　四、操作步骤 　　1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。　　2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。　　3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。　　4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。 　　5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。　　6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。　　7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。 　　[注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。 \n　　2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。  第四节 cDNA合成技术 　　一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA合成技术 　　Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：　　20μg 特异性引物 　　200μl M-MLV第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl; 　　　　　15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L) 　　2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂 　　10,000μ M-MLV反转录酶, RNase H- 　　5μg 对照RNA 　　400μl M-MLV第二链缓冲液(10×)，配方如下： 　　　　400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L \nMgCl2; 　　　　30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。 　　500μ RNase H 　　500μ DNA聚合酶Ⅰ 　　100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ 　　2×1.25ml 不含核酸酶的水 　　以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。　　（一） 第一链合成 　　1. 试剂 　　[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液。 　　2. 操作步骤 　　(1) 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O调整体积至15μl, 70℃处理5分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入 　　　5×第一链缓冲液 5μl 　　　rRNasin RNA酶抑制剂 25U 　　　M-MLV(H- )反转录酶 200U \n　　　H2 O 调至总体积25μl 　　(2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。 　　(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时 　　(4) 取出置于冰上 　　(5) 掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。 　　(6) 第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成 　　注：以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA使用125μl总体积进行合成。　　（二） 第二链合成 　　1、 取第一链反应液 20μl, 再依次加入 　　　　10×第二链缓冲液 20μl 　　　　DNA聚合酶Ⅰ 23μ 　　　　RNase H 0.8μ 　　　　H2O 加至终体积为100μl 　　2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。 \n　　3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA, 则需延长至3-4小时)。 　　4、 掺入测定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。 　　5、 cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟, 低速离心后置冰上。 　　6、 加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃温浴10分钟。 　　7、加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。 　　8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。　　9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30分钟后离心5分钟。 　　10、 小心丢去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,离心2分钟。　　11、 小心移去上清液,干燥沉淀。 　　12、 沉淀溶于10-20μl TE缓冲液。　　（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析 　　1. 试剂 　　1mg/ml鲑鱼精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（ 30mM NaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。 \n　　2. 操作步骤 　　(1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活性。 　　(2) 同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡旋混合仪混合后置冰上5-30分钟。 　　(3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 这些样品代表掺入放射性活性。 　　(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。　　3. 第一链产量测定　　第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100% 　　掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率) 　　设330为每mol dNTP的平均分子量 　　合成cDNA量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol 　　mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng)×100% 　　例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA摸板量为1μg,反应体积为25μl, 则: 　　掺入率＝3040/254000×100%=1.2 \n　　掺入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol 　　合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng 　　mRNA向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8% 　　由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链cDNA合成量为0.8×198ng=158ng。 　　4. 第二链产量计算　　除需去除第一链掺入dNTP外,方法同第一链产量计算 　　第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性?? 　　掺入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入nmol]×第二链掺入率 　　第二链cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol 　　双链cDNA转变率=双链cDNA合成量(ng)/ 单链cDNA合成量(ng) 　　例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp, 总放射性活性强度为235000cpm. 　　第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18% 　　第二链合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol 　　合成第二链cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng 　　双链cDNA转变率=155ng /158ng×100%=98% \n　　一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。　　（四） 电泳分析 　　通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的9-12步，一般第一链和第二链上样量相同。 　　1. 标准分子量DNA参照物的同位素标记 　　(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA聚合酶进行32 P标记 　　　　10×HindⅢ缓冲液 2.5μl 　　　　dATP 0.2mmol/L　　　　dGTP 0.2mmol/L 　　　　[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi 　　　　λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg 　　　　Klenow DNA聚合酶 1μ 　　　　加H2O 到总体积25μl 　　(2) 室温放置10分钟, 加2.5μl 200mM EDTA终止反应, 加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。 　　2. 电泳分析 　　(1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。 　　(2) 取样品液, 用TE调整体积, \n使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉兰）。 　　(3) 加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处，电泳缓冲液为30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。 　　(4) 将胶浸入7% TCA中,室温放置30分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。 　　(5) 用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X光片(用增感屏时-70℃压片)。　　 二、其它cDNA合成技术 　　除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技术外，Promega公司还提供有多个AMV合成试剂盒，不同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等，其余试剂一样，这些系统包括： 　　20mg 引物　　20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下：　　250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L 　　MgCl2; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT; 　　20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。 \n　　50ml 40mM焦碳酸钠 　　625m rRNasin RNA酶抑制剂 　　600m AMV反转录酶 　　5mg 1.2kb对照RNA 　　200ml 10×第二链缓冲液，配方如下： 　　400mmol/L Tris·Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L　　MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。 　　2m E.Coli RNaseH 　　500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ 　　100m T4 DNA PolymeraseⅠ 　　1.5ml 不含核酸酶的水 　　以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。　　（一）第一链合成 　　下面介绍的是25ml体积反应系统，该系统可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反应体积10ml，如5mg mRNA需55ml反应体积。 　　引物或引物-延接头和反转录酶与mRNA的比例应分别保持为0.5mg/mg（对NotⅠ引物-延接头为0.3mg/mg）和15m/mg. 　　1、试剂： 　　[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM\n)，TE饱和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE缓冲液(10mM Tris·Cl,pH8.0,1mm EDTA)。 　　2、操作步骤： 　　（1）取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管加入的RNA样品，及引物或引物-延接头，用H2O调节0.5mg引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接头/mg mRNA）的体积至15ml，70℃加热5分钟，待冷至室温，离心数秒钟使溶液集中在管底，然后依次加入： 　　　　5×第一链缓冲液 5ml 　　　　rRNasinR RNA酶抑制剂 25ml 　　　　40mM焦碳酸钠2.5ml 　　　　AMV反转录酶 15m/mg RNA 　　　　加无水RNA酶水至总体积25ml 　　在加入焦碳酸钠和AMV反转录酶前，需将反应液42℃温浴5分钟，以阻止焦碳酸钠沉淀。焦碳酸钠主要用于抑止第一链形成发夹结构。 　　（2）轻弹eppendorf管，取出5ml至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其体积不能超过1ml），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。 　　（3）42℃温浴1小时。 　　（4）取出置冰上。 　　（5）掺入测定的eppendorf管加入50mM \nEDTA，终止反应，并使总体积为100ml。可取90ml进行电泳分析，另10ml进行同位素掺入测定。 　　（6）第一链合成离心管可直接用于第二链合成。　　（二）第二链合成 　　第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。　　1、第一链反应液（20ml）中依次加入 　　　　10X 第二链缓冲液 10ml 　　　　E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m 　　　　E.Coli RNaseH 0.8m 　　　　加无核酸酶水至总体积 100ml 　　余下步骤同本章第四节一（二）2-12步及（三）和（四）。 分子生物学实验技术(第五章　重组质粒的连接、转化及筛选)第五章　重组质粒的连接、转化及筛选第一节 概 述 　　质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, \n如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。　　外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 　　1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。　　2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 　　3、带有平末端 \n是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 　　本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。 　　因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 　　pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α\n融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。  第二节 材料、设备及试剂 　　一、 材料 　　外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 　　二、 设备 　　恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台， \n微量移液枪，eppendorf管。 　　三、 试剂　　1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L ATP（过滤灭菌）。 　　2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。　　3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。　　4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。 　　5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。 　　6、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。　　7、感受态细胞制备试剂: 见第三章。 　　8、煮沸法快速分离质粒试剂: \n见第一章。　　9、质粒酶及电泳试剂: 见第二章。 第三节 操作步骤 　　一、 连接反应 　　1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。 　　2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。 　　3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。　　4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。 　　同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。　　二、 E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化　　每组连接反应混和物各取2μl转化E. coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。　　三、 重组质粒的筛选 　　1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。 　　2、倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。 　　3、放于4℃数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做）。 \n　　不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。 　　四、 酶切鉴定重组质粒 　　用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。　　[注意] 1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 　　2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。 　　3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。 　　4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。 \n　　5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。 　　6、麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。 　　7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。 　　8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。 分子生物学实验技术(第六章基因组DNA的提取)第六章 基因组DNA的提取第一节 概 述 \n　　基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。　　不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。　　本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 第二节 从植物组织提取基因组DNA \n　　一、材料 　　水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 　　二、设备 　　移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 　　三、试剂 　　1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 　　2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。　　3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 　　4、 RnaseA母液：配方见第一章。 　　5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 　　四、操作步骤：　　（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 　　1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 　　2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 \n　　3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 　　4. 室温下5000rpm离心5分钟。 　　5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 　　6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。 　　7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 　　8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。 　　9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 　　10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 　　11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 　　12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。 　　13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, \n检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。　　[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。　　（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA 　　1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。 　　2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。 　　3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。 　　4. 同本节（一）中步骤3-13操作。  第三节 从动物组织提取基因组DNA 　　一、材料 　　哺乳动物新鲜组织。 　　二、设备 　　移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 　　三、试剂 　　1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 　　2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L \nNaCl，3mol/L NaAc，TE。 　　四、操作步骤:　　1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。 　　2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。 　　3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 　　4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。 　　5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。 　　6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。　　7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 　　8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 　　9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 　　10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。 　　11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。  第四节 细菌基因组DNA的制备 \n　　一、材料 　　细菌培养物。 　　二、设备 　　移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 　　三、试剂 　　1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 　　2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 　　四、操作步骤：　　1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 　　2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 　　3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 　　4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 　　5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 　　6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 \n　　7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 　　8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 　　9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 第五节 基因组DNA的检测 　　上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。　　1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。 　　2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。 　　3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。 　　如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理： \n　　（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 　　（2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 　　（3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。 　　（4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。 分子生物学实验技术(第七章RFLP和RAPD技术)第七章 RFLP和RAPD技术第一节 概 述 　　DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length \nPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。　　运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, \n但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。 　　本实验将学习RFLP的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。  第二节　RFLP技术 　　一、 材料 　　基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。 　　二、设备 　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 　　三、试剂： 　　1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 　　2、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 　　3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。 　　4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。 　　5、10×SSC：配方见第九章。 \n　　6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。 　　四. 操作步骤 　　1. 基因组DNA的酶解 　　(1) 大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验,要求提取的DNA分子量大于50kb, 没有降解。　　(2) 在50μl反应体系中,进行酶切反应:　　　　5μg基因组DNA 　　　　5μl 10×酶切缓冲液 　　　　20单位（U）限制酶(任意一种) 　　　　加ddH2 O, 至50μl 　　(3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。　　(4) 取5μl反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。 　　[注意] 未酶切的DNA要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。 　　2. Southern转移 　　（1） 酶解的DNA经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。 　　　　（2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤, 10分钟。 　　　　（3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, \n转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。 　　（4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。 　　（5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速转至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。　　（6） 将膜夹于2层滤纸内, 80℃真空干燥2小时。 　　（7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。　　[注意] 1、 步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。　　　　　　2、 除步骤（1）、（4）、（5）外, 其余均在摇床上进行操作。　　　　　　3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。　　　　　　4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。 第三节 RAPD技术 　　一、 材料　　不同来源的DNA(50ng/ul)。 　　二、设备 　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。 　　三、试剂 \n　　1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。 　　2、Taq酶：购买成品。 　　3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。　　4、MgCl2 ：25mmol/L。 　　5、dNTP：每种2.5mmol/L。 　　四、操作步骤： 　　1. 在25ul反应体系中,加入 　　　　模板DNA 1ul (50ng) 　　　　随机引物 1ul (约5pmol) 　　　　10xPCR Buffer 2.5ul 　　　　MgCl2 2ul 　　　　dNTP 2ul 　　　　Taq酶 1单位（U） 　　　　加ddH2O 至 25ul 　　混匀稍离心, 加一滴矿物油。 　　2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。 　　3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。　　4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。 　　5. 电泳结束，观察、拍照。 \n　　[注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。　　　　　　2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。 窗体顶端分子生物学实验技术(第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆)第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节 概 述 　　PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。　　一、 PCR反应中的主要成份　　1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp， \n太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。 \n　　2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 　　3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。　　4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μ\ng的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。　　5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。　　6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ . Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种Taq \nDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。　　二、PCR反应参数　　1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。　　2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃-55℃,1-2min。　　3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃\n.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 　　4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。　　扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为增效率, n为循环次数。 　　在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。 \n　　三、PCR产物的克隆 　　在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。　　1. 平末端连接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。 　　2. 在PCR产物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复.目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。 　　3. 粘性末端连接：利用引物中附加在5'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。  第二节 材料、设备及试剂 \n　　一、材料 　　不同来源的模板DNA。 　　二、设备 　　移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。 　　三、试剂： 　　1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。　　2、MgCl2 ：25mmol/L。 　　3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。 　　4、Taq DNA聚合酶5U/μl。 　　5、T4 DNA连接酶及连接缓冲液：配方见第五章。 　　6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。 　　7、其它试剂：矿物油（石蜡油），1% 琼脂糖，5×TBE，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇和70％ 乙醇。  第三节　操作步骤 　　一、PCR反应 　　1. 依次混匀下列试剂　　　35μl H2 O　　　5μl 10×PCR反应缓冲液　　　4μl 25mmol/L MgCl2 \n　　　4μl 4种dNTP 　　　0.5μl 上游引物（引物１） 　　　0.5μl 下游引物（引物２）　　　0.5μl 模板DNA(约1ng) 　　混匀后离心5秒。　　2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。　　3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。 　　二、电泳 　　按第二章所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。　　三、PCR产物的纯化 　　扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。 　　（一）酚/氯仿法 　　1.取反应产物加100μl TE.。 　　2.加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中. 这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。 \n　　3.再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。 　　4.在水相中加300μl 95％乙醇,置-20℃下30min沉淀。 　　5.在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入1ml 70％乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。 　　（二）Wizard PCR DNA纯化系统 　　Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 　　该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：　　　50ml Wizard PCR DNA纯化树脂 　　　5ml 直接提取缓冲液 　　　50支 Wizard微型柱 　　1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。 　　2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。 　　3、加1ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。　　4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。　　5、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml 80%异丙 醇，对微型柱进行清洗。　　6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g\n离心20秒，以除去微型柱中的洗液。　　7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。　　8、丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。　　[注意] 1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。 　　　　　　2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。　　四、载体加dT尾 　　1.将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。 　　2.在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。 　　3.加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2h。 　　4.按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。 　　5.加入2倍体积 95％乙醇,在-20℃下沉淀1hr。 　　6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。 　　五、PCR产物与载体粘末端连接 　　1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。 　　2、加1ml T4DNA连接酶，1ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。 \n　　3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。　　六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接 　　1. 在50ml的PCR产物中,直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混匀。 　　2. 37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。 　　3. 用酚:氯仿抽提2次。 　　4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。 　　5. 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1ml （约0.1mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1ml ，连接缓冲液1ml 。　　6. 取5ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。　　[注意]1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。　　　　　2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。　　　　　3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。　　　　　4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 　　思考题 　　1.降低退火温度对反应有何影响？ 　　2.延长变性时间对反应有何影响？ \n　　3.循环次数是否越多越好？为何？　　4.如果出现非特异性带,可能有哪些原因？  分子生物学实验技术(第十章测序技术)第十章 测序技术 　　在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。 　　Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。  \n第一节 非同位素银染测序系统操作技术 　　一、概述： 　　Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物， 减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。　　Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。 \n　　退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。 　　由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。　　二、材料 待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。 　　三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。　　四、试剂 　　（1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。 　　（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。 \n　　（3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。 　　（4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。 　　（5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。 　　（6）TEMED 　　（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。 　　（8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。 　　（9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。 　　（10）95%乙醇。 　　（11）0.5%冰乙酸。 　　（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。 　　五、操作步骤： 　　成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点： \n　　　　（1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。 　　　　（2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。 　　　　（3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。  （一）测序反应： 　　　　　1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。 　　 　　2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂： 　　　　（1） 样品反应： 　　　　　　质粒模板DNA 2.1pmol 　　　　　　5×测序缓冲液 5ml 　　　　　　引物 4.5pmol \n　　　　　　无菌ddH2O 至终体积16ml 　　　　（2）对照反应 　　　　pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg)　　 4.0ml 　　　　　　5×测序缓冲液 5ml 　　　　　　pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml 　　　　　　无菌ddH2 O 至终体积 16 ml 　　3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。　　4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。　　5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。　　6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。 　　7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。　　[注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入： 模板种类/长度 模板量 200bp (PCR产物) 16ng(120fmol) \n3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol) 　　由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。 　　　　2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式： 　　　　4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数 　　　　计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式： 　　　　dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数 　　　　ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数 　　3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。 　　　　模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50% 　　95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。 　　　　模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。　　95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。 　　（二）、 \n测序凝胶板的制备　　1、玻璃板的处理： 　　银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。 　　（1）短玻璃板的处理 　　A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。 　　B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。 　　C. 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。 　　[注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。　　　　　　2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。 　　　　　　3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。　　(2)、长玻璃板的处理 　　A. 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。 \n　　B. 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。 　　　　[注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。 　　2、凝胶的制备： 　　（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。　　（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。   凝胶终浓度   3 4 5 6 8 12 16 18 尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 \nAcr&Bis(ml) 7.5  10.0  12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0 10×TBE缓冲液(ml)  10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 双蒸水(ml)  47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0 10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40 　　(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。 　　[注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。 　　　　　　2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。 　　（三）电泳： 　　1、预电泳 　　（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。 　　（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。 　　（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。 \n　　（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。 　　（5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。 　　[注意] 　　（1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。 　　（2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。 　　2、样品的制备：　　当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4-6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。 　　3、上样及电泳 \n　　关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长，0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。 　　[注意] 　　1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。 　　2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。 　　（四）、 测序凝胶的银染　　染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 　　　　1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 　　　　2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 \n　　　　3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 　　　　4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 　　　　5. 凝胶显影： 　　　(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。 　　　(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。 　　　(3). 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。 　　　　6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。 　　　　7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。　　8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。 　　[注意]　测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。 \n　　　　　　　　1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得　　　　较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。 　　　　　　　　2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂　　　　级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。 　　　　　　3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或　　　　没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。 　　　　　　　　4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果　　　　凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。 　　　　　　　　5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注　　　　意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶　　　　液。 　　（五）、EDF胶片显影 　　　使用EDF胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。 \n　　　　1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间, 用一小条EDF胶片曝光不同时间, 检查不同的曝光强度, 一般曝光20--40秒可得较好结果。 　　2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角, 然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。 　　3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20秒。 　　4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片，可使用下列操作过程: 　　　　　a. 在Kodak GBX显影液中显影1-5分钟; 　　　　　b. 水洗1分钟; 　　　　　c. 在Kodak GBX定影液中定影3分钟; 　　　　　d. 水洗1分钟. 　　[注意] 1. 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作, 以免印上指纹。同时注意　　　　　EDF胶片不能用自动胶片处理器。 　　　　　　2. 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用　　　光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。 　　　　　　3. \n曝光时间短则EDF胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。 第二节 T7 DN A聚合酶测序技术 　　一、概述 　　T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称T7测序酶。 使用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此, 放射自显影所得到的结果较为清晰易辩, 对于许多模板来说, 使用含有dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而, 如果出现了带压缩的问题，则用含dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入，使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。 　　T7测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且不需要进行追加反应(Chase step)。 然而对于有紧密二级结构的区域, 错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况，应使用一些高温DNA聚合酶，如Promega公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。 　　T7 \nDNA聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow酶和AMV反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5'-3'的DNA合成活性和极低的3'-5'端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反转录酶AMV而言，则可使条带非常的均一，并且它的放射性背景极低。 　　T7 DNA聚合酶测序时DNA的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第二步方为双脱氧链末端终止的DNA合成过程。在第一步过程中，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的DNA片段。 　　二、材料 待测的DNA模板，可用双链或单链模板。 　　三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，照相显影用大号塑料盆，制胶设备，吹风机，放射自显影盒，X-光片。 　　四、试剂 　　1、5×T7 DNA聚合酶缓冲液：200mmol/L Tris·Cl, pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 250mmol/L NaCl。 　　2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。 　　3、DTT ： 0.1mol/L。 　　4、5×常规标记混合物：7.5mmol/L dGTP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。 \n　　5、5×dITP标记混合物：15mmol/L dITP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。 　　6、dNTP A溶液（适用于dGTP): 80mmol/L dGTP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCL。 　　7、ddG终止混合物 (适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddGTP。 　　8、ddA终止混合物 (适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddATP。 　　9、ddT终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddTTP。 　　10、ddC 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddCTP。 　　11、dNTP B溶液（适用于dITP): 160mmol/L dITP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCl。 　　12、ddG终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddGTP。 　　13、ddA 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddATP。 　　14、ddT 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddTTP。 \n　　15、dd C终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddCTP。 　　16、测序用T7 DNA测序酶。 　　17、酶稀释缓冲液：10mmol/L Tris·HCl, pH7.5, 5mmol/L DTT, 0.5mg/ml BSA 。 　　18、终止溶液： 95%甲酰胺，20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰 。 　　19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP, 35S的优点是可使条带为窄而清晰，并且操作更为安全。放射强度为：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。　　20、TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, pH7.5。　　21、上节所述的凝胶制备过程中的全套试剂。　　22、X光显影液：H2O：50℃ 800ml，米吐尔 2.2g，无水Na2SO3 72g，对苯二酚 8.8g，无水NaCO3 48g , KBr 4g， 定容至1000ml备用。 　　23、F-5坚膜定影液：水600ml , Na2S2O3 240g, Na2SO3 15g, 冰醋酸 13.4ml；硼酸 7.5g ，粉状钾矾 15g ，定容至1000ml 备用。 　　24、TYP肉汁培养基：16g蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl, 2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。　　25、20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液：40% \nPEG（分子量8000）储备液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac储备液等体积混合。 　　五、操作步骤： 　　（一）、模板制备 　　1、M13单链模板制备：在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG的培养基上铺板之后, 含有M13重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑"，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的细菌慢的缘故, 从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。 　　　（1）过夜培养的宿主细胞(如NM522或JM101)用3ml TYP肉汁培养基以1:100稀释。在37℃强烈震荡1小时之后, 细胞进入对数早期。此时, 将一个合适的含有重组M13的噬菌斑(连同琼脂)用滴管转入该细胞培养液中。　　　（2）37℃强烈震荡(300rpm) 培养6小时。 　　　（3）把细胞培养液转入两只1.5ml eppendorf管, 12000g离心15分钟。上清液转移到新的eppendorf管再离心15分钟。小心地取出1-1.2ml上清液(注意不能触及沉淀), 再转到新的eppendorf管。 .　　　（4）将0.25体积的含20％PEG(-8000)的3.75M醋酸铵(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌体。混匀后置冰上30分钟, 再以12000g离心15分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一次, \n用吸液器尖头将残留的PEG充分吸干净。此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。 　　　（5）将沉淀物重溶于400ml TE缓冲液中。 　　　（6）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈震荡1分钟，12000g离心5分钟。 　　　（7）将水相转入一新的eppendorf管, 注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡1分钟, 12000g离心5分钟。 　　　（8）将上层水相转入另一新的eppendorf管, 重复第7步的提取, 如有必要重复多次直至二相之间无可见物质存在。 　　　（9）将上层水相转入一新的eppendorf管, 加等体积氯仿, 强烈振荡1分钟后, 12000g离心5分钟, 多次重复此步骤。 　　　（10）将上层水相转入新的eppendorf管, 加0.5倍体积的7.5 mol/L 醋酸铵, 2倍体积乙醇, 混匀后-20℃放置 30分钟。 　　　（11）12000g离心15分钟, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被搅起, 重新离心, 倾去酒精, 真空干燥沉淀物。 　　　（12）将DNA的沉淀物溶解于20ml去离子水中，取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳定量, 如果DNA量充足, \n则可进行退火测序。　　2、噬粒(Phagemid)单链模板的制备：噬粒是指含有丝状单链DNA噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的质粒均属噬粒。含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感染后就能产生测序反应所需的单链DNA模板。 　　　（1）从新鲜平板上挑得含pGEM质粒DNA的抗Amp单菌落, 并接种到100ml含有50mg/ml氨苄的TYP肉汤培养基中, 在37℃振荡过夜。 　　　（2）取100ml过夜培养物接种到另一新的装有5ml 含50mg/mlAmp的TYP肉汁培养基的试管中, 在37℃强烈振荡30分钟。 　　　（3）加40μl辅助噬菌体R408或M13 K07, 继续剧烈搅拌振荡培养6-8小时，使辅助噬菌体超感染。 　　　（4）12000g离心15分钟后，去除沉淀，取上清，转移到一新eppendorf管中再次离心15分钟, 小心地取1-1.2ml上清液(注意不能触及沉淀)。 　　　（5）将0.25体积的含20％ PEG-的3.75M醋酸铵加入上清液以沉淀噬菌体颗粒。混匀后置冰上30分钟, 再以12000g离心15分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一次, 用移液器尖头将残留的PEG溶液吸净。此时应能看到管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。 　　　（6）将沉淀物溶解于400ml TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)。 　　　（7）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈振荡1分钟, \n再以12000g离心5分钟。 　　　（8）将水相转入一干净eppendorf管(不要触动原管中两相交界面), 加等体积酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡1分钟, 12000g离心5分钟。 　　　（9）上层水相转入一干净eppendorf管重复第8步骤提取, 如有必要重复多次直至二相之间无可见物质。 　　　（10）将上层水相转入一干净eppendorf管加等体积氯仿, 强烈振荡1分钟后离心, 多次重复此步骤。 　　　（11）将上层水相转入一干净eppendorf管加0.5倍体积7.5mol/L pH7.5醋酸铵, 再加2倍体积乙醇, 混和后-20℃放置30分钟。 　　　（12）12000g离心15分钟, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如沉淀已被搅起,重新离心, 倾去乙醇, 真空干燥沉淀。 　　　（13）将沉淀物溶解于20ml去离子水中, 取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳进行定量，如果DNA量充足，则进行退火和测序。 　　3、质粒膜板制备：参照第一章所述的方法。　　（二）超螺旋质粒DNA的碱变性：　　1、取4mg（约2pmol）超螺旋质粒DNA至一eppendorf管中，加无离子水到终体积18ml。 　　2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液, 置于室温(25℃下）保温5分钟。 \n　　3、加2ml 2mol/L NaAc溶液(pH4.6)涡旋混匀，使之中和。 　　4、加75ml无水乙醇，充分混匀后，置于干冰或-70℃沉淀10分钟。 　　5、于12000g离心10分钟，弃去上清，用200ml预冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml无离子水中。　　（三）、测序反应：　　1、引物和模板的退火： 　　（1）在一离心管中，混合如下几种试剂： 　　　　引物 约1-2pmol 　　　　5×T7 DNA聚合酶测序反应缓冲液 2ml 　　　　DNA 约1mg 　　　　加ddH2O终体积至10ml 。 　　（2）将试管盖盖上后，65℃ 加热2分钟，然后在大约30分钟左右的时间内，使试管的温度缓慢地降到室温。降温的过程中可使用小的加热板或小型的保温仪，也可使用已调至65℃的水浴，使它们的温度在室温下缓慢地降至室温即可。当温度降至30℃以下时，退火结束。可将小试管置于冰上，退火完毕的模板须在4小时内使用。 　　2、标记反应 　　（1）在一个标准的反应过程中（从引物处开始，可读到500个碱基以上），首先需要按1:5稀释标记混合物。如4ml 混合物则加双蒸无离子水16ml。该稀释液储存在 -20℃\n可使用数周。如果所要测定的序列小于30个碱基，可将标记缓冲液稀释15倍，同时，模板DNA要高于0.5pmol。由于DNA模板量的不足，会降低标记反应的程度，即只标记引物后的几个核苷酸。 　　（2）用冰预冷的TE缓冲液按1:8稀释T7 DNA聚合酶。酶液稀释后应立即使用，置于冰浴不宜超过60分钟。不得使用标记混合物、DTT溶液或非缓冲液类溶液稀释酶液。 　　（3）在已退火的引物 -模板混合物中，依次加入： 　　　　0.1mol/L DTT 1.0ml　　　　标记混合物 2.0ml 　　　　[a-35P]dATP或[a-35S]dATP 0.5ml 　　　　已稀释好的T7 DNA聚合酶 2.0ml 　　混合充分（注意不得产生气泡），置于室温5-10分钟。 　　如果在电泳时碰到带压缩问题，则dITP 混合物的效果优于dGTP混合物，dITP混合物的使用方法与dGTP混合物的使用是相似的。　　[注意] 1、稀释时应将所有的溶液预先混合完全后再加入酶液。 　　　　　　2、在第（3）步的过程中，如果反应中有几次冷却，保温的时间过长或温度太高的话，则会使测序反应短于100个碱基。 　　　　　　3、链终止反应： 　　　　　　（1）取4支eppendorf管分别标上G，A，T，C。 　　　　　　（2）每个管分别加入2.5ml \nG，A，T，C链末端终止混合物，立即盖上盖子以防液体蒸发（本反应最好在标记反应前做好）。dGTP和dITP混合物依据各自需要 选用。 　　　　　　（3）将eppendorf管预热至37℃ 1分钟。 　　　　　　（4）待标记反应完毕后，取3.5ml标记反应液至上述4支eppendorf管中，稍微离心一下，并将上述四管置于37℃保温。注意在每一次反应中，均应使用新的吸液头，以免交叉污染。 　　　　　　（5）继续保温3-5分钟（若使用dITP时，保温时间可延长至30分钟，对反应产物没有任何影响。 　　　　　　（6）在上述四管中各加入4ml终止缓冲液。混合均匀后，置于冰浴中。本样品即可上样电泳。用35S标记反应的样品可置于-20℃保存一周，此时样品只有极少量的降解。而32P标记的则需在当天电泳以免降解。 　　（四）测序凝胶板的制备及电泳 参考第一节测序凝胶板的制备及电泳部分。样品加热至75-80℃ 2分钟，立即上样，每个泳道的使用量为2-3ml 　　（五）测序凝胶板的干燥及放射自显影。 　　电泳完毕后，经32P或35S标记的产物可用对b-射线敏感的X-光胶片放射自显影检测。 　　1、取下电泳的玻璃板，去除两边的压条，用小的薄钢片撬开玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷处理过，凝胶会紧紧地粘合于玻璃板上，则凝胶与玻璃板一起进行下面步骤的处理。如果玻璃板没有经过粘合硅烷的处理，则可用3MM大滤纸贴在有凝胶的玻璃板上，小心地揭下凝胶，准备下一步的处理。 \n　　2、去除尿素，将含有凝胶的玻璃板或滤纸浸于含有2升10%冰醋酸的大号显液盆中，轻轻振荡15分钟，去除尿素。 　　3、干胶：含有凝胶的玻璃板可用电吹风吹干，而含有凝胶的滤纸则可用专用的干胶设备如真空加热干胶仪抽干。 　　4、已经干燥的凝胶即可进行放射自显影。在玻璃板含有凝胶的这一面加上X-光片后，用另一块相似大小的玻璃板夹住，然后用夹子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝胶的滤纸则可置于X-光曝光盒中放射自显影。一般32P曝光过夜即可，而35S为2-3天。 　　5、曝光完毕后的X-光片即可冲洗，获得序列信息。将X光片置于水中先湿润，然后置于显影液中显影，直至条带清晰显示为止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15分钟以上。取出X-光片干燥并读出序列。　　[ 注意] 1、去除尿素是非常重要的，如果有残存的尿素，则在干胶过程中会使凝胶很粘，而无法进行放射自显影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15分钟，第二次10分钟。如果胶浓度高于12%，则有可能在干胶过程中会产生皱纹，防止的方法有二种：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；（2）不干燥胶，直接在冰箱中以冰冻状态曝光，应注意的是在使用这个方法时，要在凝胶和X-光片之间加一层薄的塑料薄膜。一般来说都使用第一种方法。 \n　　2、凝胶一定要充分干燥方可进行曝光，否则X-光片会粘在胶的表面，致使以后的操作困难。　　3、曝光时间应根据所使用的同位素而定，如果同位素已过半衰期则应相应延长曝光的时间。 　　思考题： 　　1、影响银染测序结果的主要因素是什么？应如何消除？ 　　2、使用T7 DNA聚合酶测序时，需要获得较长的序列信息，可使用哪些方法解决？